Năm 1927, ông tham gia tổ chức Việt Nam Thanh niên cách mạng đồng chí hội. Năm 1931 ông bị bắt và bị đưa ra nhà tù Côn Đảo. Năm 1935, ông cùng một số tù chính trị vượt ngục, trở về đất liền, hoạt động cách mạng tại Nam Bộ, sau đó được phân công phụ trách công tác tuyên truyền, in ấn tài liệu cách mạng.

Chính trong thời gian này, ông được xứ ủy Nam Kỳ trao nhiệm vụ vẽ cờ hiệu để sử dụng trong các cuộc đấu tranh. Ông đã vẽ lá cờ có nền đỏ và ngôi sao vàng năm cánh, thể hiện ý tưởng máu đỏ da vàng, tượng trưng cho dân tộc và sự đoàn kết các tầng lớp nhân dân bao gồm sĩ, nông, công, thương, binh trong đại gia đình các dân tộc Việt Nam. Mẫu cờ đã được xứ ủy Nam Kỳ nhất trí và đã xuất hiện lần đầu tiên trong khởi nghĩa Nam Kỳ ngày 23 tháng 11 năm 1940.

Tâm huyết của tác giả khi sáng tạo ra lá cờ được khắc họa rõ nét trong bài thơ của ông:

Hỡi những ai máu đỏ da vàng
Hãy chiến đấu dưới cờ thiêng Tổ quốc
Nền cờ thắm máu đào vì nước
Sao vàng tươi, da của giống nòi
Đứng lên mau hồn nước gọi ta rồi
Hỡi sỹ-nông-công-thương-binh
Đoàn kết lại như sao vàng năm cánh.
 

Tuy nhiên, ông không kịp nhìn thấy lá cờ của mình tung bay. Tháng 8 năm 1940, ông bị thực dân Pháp bắt giam. Khởi nghĩa Nam Kỳ thất bại và bị khủng bố tàn bạo. Thực dân Pháp đưa ông và nhiều yếu nhân của Đảng Cộng sản Đông Dương như Nguyễn Thị Minh Khai, Võ Văn Tần, Hà Huy Tập, ... xử bắn ngày 28 tháng 8 năm 1941.

Lá cờ của Nguyễn Hữu Tiến đã lan rộng ra và trở thành cờ hiệu của phong trào Việt Minh. Tại hội nghị Tân Trào chuẩn bị tổng khởi nghĩa, quốc dân đại hội đã nhất trí chọn lá cờ của Nguyễn Hữu Tiến làm quốc kỳ của đất nước Việt Nam độc lập.